EMSA凝膠阻滯-DAP-seq

EMSA凝膠阻滯-DAP-seq

EMSA凝膠/電泳遷移率實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)常見問題

1、EMSA原理及方法

EMSA 稱凝聚阻滯實(shí)驗(yàn)或凝膠電泳遷移率檢測， 是一種用于研究轉(zhuǎn)錄因子和其相關(guān)的 DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)， 能對各類轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合活性進(jìn)行定性和半定量分析，是一項(xiàng)研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

EMSA 主要基于蛋白-探針復(fù)合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí)，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物；這種復(fù)合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，蛋白-探針復(fù)合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標(biāo)探針有互作。

2、看不到遷移條帶

1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。

3）探針與蛋白無特異性的相互作用。

4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。

5）曝光或者成像時(shí)間過短。

6) 在 Super-Shift EMSA 測定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因：

a. 抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于 Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于 Super-Shift EMSA。

b. 測定的活化的 DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測的構(gòu)成成分存在。此時(shí)既看不到 Super-Shift 的帶，也看不到 DNA/蛋白復(fù)合物的量的減少。

c. 使用的抗體過度稀釋。一般 10～20 ul 的反應(yīng)液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗體。

d. 多抗與 DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下，雖然看不到 Super-Shift 的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到 DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。

3、實(shí)驗(yàn)背景高

1）曝光或者成像時(shí)間過長。

2）封閉時(shí)間不足或者效率不高。

3）洗滌效果不佳。

4）實(shí)驗(yàn)過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。

5）蛋白的質(zhì)量不高，雜質(zhì)多

4、EMSA如何設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)及其目的

EMSA實(shí)驗(yàn)會有如下對照組：
(1)陰性對照反應(yīng)(標(biāo)記探針)；
(2)常規(guī)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針)；
(3)探針冷競爭反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針＋標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針)；
(4)突變探針的冷競爭反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針＋標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針)；
(5)Super-shift反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針＋目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體)。

每個(gè)對照組的目的：
(1)確定探針里面是否有雜質(zhì)，光有探針，沒有其他成分時(shí)，探針的位置，應(yīng)該位于下方。
(2)這個(gè)是看蛋白和探針的結(jié)合，是實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br/>(3)看探針結(jié)合的特異性。如果冷探針可以競爭結(jié)合，阻礙了標(biāo)記的探針，說明2中的結(jié)合是特異的
(4)目的和3相同。突變的冷探針應(yīng)該對2的結(jié)果沒有影響
(5)也是判斷特異性，這次是看蛋白的特異性，和抗體結(jié)合后，就會有super-shift。如果沒有，說明是其他的蛋白結(jié)合。

5、EMSA非放射性探針設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

（1）EMSA探針不宜太長，一般是幾十堿基對。太長會產(chǎn)生過多結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致結(jié)果分析困難，還會產(chǎn)生超級螺旋結(jié)構(gòu)而掩蓋結(jié)合部位

（2）注意AT/GC比例

（3）防止產(chǎn)生空間位阻

（4）防止錯(cuò)位配對、封閉成環(huán)，排除目標(biāo)序列以外結(jié)合位點(diǎn)

（5）推薦Biotin或紅外熒光標(biāo)記，盡量不要用DIG標(biāo)記。