Polysome profiling是基于蔗糖密度梯度離心，將細(xì)胞質(zhì)RNA分離成多個組分：游離RNA,結(jié)合核糖體40S或60S亞基、單核糖體(80S)或多聚核糖體等。后續(xù)可以分別收集40S、60S、80S和多聚核糖體，用于RNA或蛋白質(zhì)分析，也可以通過酶消化檢測disome等等。

1：Disome/Trisome-seq  

在polysome profiling基礎(chǔ)上進(jìn)行酶切處理，酶切去除未被核糖體保護的mRNA，只測序核糖體保護的短片段（RPF）；通過發(fā)現(xiàn)disome或trisome的變化來檢測核糖體碰撞(collision)與翻譯停滯(stalling)現(xiàn)象。

文獻(xiàn)案例：突變亨廷頓蛋白在亨廷頓病細(xì)胞模型中阻滯核糖體并抑制蛋白質(zhì)合成

文章題目：Mutant Huntingtin stalls ribosomes and represses protein synthesis in a cellular model of Huntington disease

這篇研究論文主要探討了亨廷頓病（Huntington's disease, HD）中突變亨廷頓蛋白（mutant huntingtin, mHTT）如何通過影響核糖體功能和蛋白質(zhì)合成來導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變的機制，為理解HD的發(fā)病機制和開發(fā)治療方法提供了重要線索。

 Hectd1 HD 細(xì)胞蛋白質(zhì)合成抑制和核糖體停滯

文獻(xiàn)案例：Disome-seq揭示了促進(jìn)共翻譯蛋白折疊的廣泛核糖體碰撞成

文章題目：Disome-seq reveals widespread ribosome collisions that promote cotranslational protein folding

研究通過創(chuàng)新的 Disome-seq 技術(shù)（測序雙核糖體保護的 mRNA 片段），系統(tǒng)揭示了酵母細(xì)胞中廣泛存在的核糖體碰撞現(xiàn)象及其在蛋白質(zhì)折疊調(diào)控中的關(guān)鍵作用。該研究證明核糖體碰撞是細(xì)胞調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的普遍策略，通過序列特異的翻譯暫停和伴侶蛋白協(xié)同，確保新生肽鏈的正確折疊，為理解蛋白質(zhì)折疊疾病（如神經(jīng)退行性疾?。┨峁┝诵乱暯恰?/span>

 Disome-seq 測定核糖體碰撞

2：Polysome-seq 多聚核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)錄本測序

在polysome profiling的基礎(chǔ)上，提取多聚核糖體各組分樣本中的RNA，進(jìn)行RNA-seq測序，深入分析特定mRNA的翻譯狀態(tài)和多聚核糖體分布特征。

文獻(xiàn)案例：RNA 結(jié)合蛋白 PRRC2B 介導(dǎo)特定 mRNA 的翻譯并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程

文章題目：RNA binding protein PRRC2B mediates translation of specific mRNAs and regulates cell cycle progression

PRRC2B 通過結(jié)合特定 mRNA 的 5'UTR 區(qū)，招募 eIF4G2/eIF3 復(fù)合物促進(jìn)翻譯，進(jìn)而驅(qū)動細(xì)胞周期進(jìn)程。技術(shù)借鑒：整合 PAR-CLIP、多核糖體測序、質(zhì)譜互作組分析等技術(shù)。該研究揭示了 RNA 結(jié)合蛋白在翻譯調(diào)控中的新機制，為癌癥治療提供了潛在靶點。

 PRRC2B 結(jié)合的 mRNA 在 PRRC2B 敲除后表現(xiàn)出翻譯效率降低

注：A 圖為 Polysome profiling 流程示意圖，D 和 E 圖為 Polysome-seq 分析翻譯效率差異圖，F(xiàn) 和 G 圖為 Polysome-qPCR 分析特定基因翻譯效率圖。 

3：Polysome profiling+RT-qPCR

梯度分離多聚核糖體區(qū)域后，用RT-qPCR定量特定基因在各組分的分布，可用于目標(biāo)基因翻譯活躍度驗證，藥物或處理條件下翻譯變化監(jiān)測

[內(nèi)參法}文獻(xiàn)案例：利用多聚核糖體譜分析和定量PCR鑒定懸浮細(xì)胞系中潛在的微肽編碼長鏈非編碼RNA

文章題目：Polysome profiling followed by quantitative PCR for identifying potential micropeptide encoding long non-coding RNAs in suspension cell lines

該研究是通過懸浮細(xì)胞系中的多核糖體分析來篩選潛在的微肽編碼lncRNA。當(dāng)與定量PCR相結(jié)合，有助于同時識別許多翻譯lncRNA。

作者在完成polysome分離后，對各組分進(jìn)行了RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄。在通過 RT-qPCR篩選可能翻譯的lncRNA時，設(shè)置了陽性和陰性對照，以評價結(jié)果的穩(wěn)健性。GAPDH等管家基因的mRNA可作為陽性對照；已知的細(xì)胞質(zhì)非編碼RNA，如hY1，可以作為陰性對照。GAPDH的峰值應(yīng)位于高多核組分中，而hY1應(yīng)富集在亞單體組分中。在 polysome組分中具有突出峰值的候選lncRNA可能表明在細(xì)胞中激活翻譯。

qPCR數(shù)據(jù)分析

每個組分中RNA百分比的計算如下：

X = 計算的組分?jǐn)?shù)；Y= 組分?jǐn)?shù)總數(shù)。

注：A 圖為 Polysome profiling多聚核糖體譜，B 圖為 Polysome-qPCR結(jié)果：目標(biāo)lncRNA的分布。蛋白質(zhì)編碼mRNA GAPDH用作陽性對照。非編碼RNA hY1用作陰性對照。

【外參法】文獻(xiàn)案例：利用多聚核糖體分析翻譯過程中mRNA及其相關(guān)蛋白

文章題目：Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation

本方案包括從梯度組分中提取RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR (RT-qPCR)、qPCR數(shù)據(jù)處理。其中引入了熒光素酶RNA（FLuc RNA）做標(biāo)準(zhǔn)化。

qPCR數(shù)據(jù)分析

在所有組分中檢測到的目的轉(zhuǎn)錄本的總數(shù)設(shè)置為100%，每個組分中目的轉(zhuǎn)錄本的比例用百分比表示。

4：Polysome profiling+WB

WB/質(zhì)譜驗證翻譯活性，還可分析翻譯調(diào)控因子的功能

文獻(xiàn)案例：HectD1通過調(diào)控核糖體組裝和蛋白質(zhì)合成來控制造血干細(xì)胞再生

文章題目：HectD1 controls hematopoietic stem cell regeneration by coordinating ribosome assembly and protein synthesis

HectD1 通過泛素化降解 ZNF622，調(diào)控核糖體組裝和蛋白質(zhì)翻譯效率，從而維持 HSC 在應(yīng)激條件下的再生能力。理論意義：揭示泛素化修飾在核糖體組裝和 HSC 再生中的關(guān)鍵作用，為理解核糖體病的發(fā)病機制提供了新視角。臨床意義：ZNF622 可能是治療骨髓衰竭綜合征（如 Shwachman-Diamond 綜合征）的潛在靶點。

Hectd1 缺失導(dǎo)致 ZNF622 和 eIF6 在 60S 中積累，核糖體亞基連接減少，ZNF622 耗竭后恢復(fù)

注：A、B 圖為 Polysome profiling 峰圖，C、D 圖為 Polysome profiling 的 western blot 分析圖。

參考文獻(xiàn)

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