文獻(xiàn)速遞

葉綠體作為植物光合作用的“能量工廠"，其從原始質(zhì)體到功能完善結(jié)構(gòu)的發(fā)育過程，受核編碼轉(zhuǎn)錄因子精密調(diào)控。目前，被子植物（如擬南芥）中的調(diào)控機(jī)制已被逐步揭開，但在非種子植物中，這些關(guān)鍵調(diào)控因子的功能是否“代代相傳"，始終是未解之謎。

2024年12月，發(fā)表在Cell Reports上的一篇題為“Streamlined regulation of chloroplast development in the liverwort Marchantia polymorpha》"的研究論文，以地錢為對象，探究了已知葉綠體生物發(fā)生調(diào)控因子（GLK、GATAs、HY5、SCL-MIR171模塊）的功能保守性。該研究借助ChIP-seq明確了MpGLK的直接靶標(biāo)基因、結(jié)合基序及調(diào)控特征，聯(lián)合ATAC-seq共同揭示了MpGLK的結(jié)合特性及與開花植物的保守性和分化。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

該研究通過系統(tǒng)發(fā)育分析，在地錢中鑒定出被子植物HY5、GLK、GATA和SCL的同源基因，分別為MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpGLK。隨后，作者構(gòu)建了MpGATA4、MpGATA2、MpSCL-MIR171、MpHY5及MpGLK的敲除突變體，發(fā)現(xiàn)地錢中MpGATA4與MpGATA2的缺失，對葉綠素合成及葉綠體發(fā)生無顯著影響，與擬南芥中同源基因的功能不保守；MpSCL不調(diào)控葉綠素含量，僅部分株系葉綠體變大，這也與擬南芥中的情況存在差異；而Mphy5突變體在低溫下會出現(xiàn)葉綠素含量降低的條件性表型，Mpglk突變體則表現(xiàn)出葉綠素積累減少、葉綠體變小的特征，二者均與擬南芥類似。綜上表明，GLK在地錢葉綠體生物發(fā)生中具有高度保守的功能，HY5的條件性作用也具備保守性。

圖1. MpGLK、MpGATAs、MpMIR171、MpSCL和MpHY5的敲除突變體

圖2. Mpglk調(diào)控葉綠體大小與超微結(jié)構(gòu)

為驗證MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpHY5功能缺失等位基因中冗余或代償性反應(yīng)是否掩蓋了對葉綠體生物發(fā)生的影響，作者構(gòu)建了它們與Mpglk的雙突變體，發(fā)現(xiàn)其葉綠素含量和表型與Mpglk單突變體無顯著差異，且過表達(dá)MpGATA4無法挽救Mpglk突變體表型，表明這些基因不存在功能冗余或代償效應(yīng)。

圖3. MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpHY5與MpGLK在地錢的葉綠體生物發(fā)生中沒有表型作用

接著，為驗證MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpGLK是否能激活葉綠體生物合成，作者構(gòu)建了由強(qiáng)組成型MpUBE2啟動子驅(qū)動的過表達(dá)株系，以EGFP標(biāo)記質(zhì)膜便于分析。結(jié)果顯示，MpGATA4、MpGATA2、MpSCL過表達(dá)對葉綠素含量和葉綠體大小無影響，MpGATA2過表達(dá)在黑暗中也無生長差異；而MpGLK過表達(dá)株系呈深綠色、生長遲緩，葉綠素含量最高達(dá)對照組4倍，且其不同版本過表達(dá)均影響葉綠素含量及葉綠體大小，還能增大非光合細(xì)胞的葉綠體。以上結(jié)果表明MpGLK可激活葉綠體生物發(fā)生。

圖4. MpGLK過表達(dá)增加葉綠素含量和葉綠體大小

進(jìn)一步對相關(guān)敲除突變體進(jìn)行RNA-seq分析，結(jié)果顯示MpSCL、MpGATA4、MpHY5敲除分別導(dǎo)致243、332、160個基因下調(diào)；MpGLK敲除使1065個基因轉(zhuǎn)錄豐度降低，與MpGATA4突變體重疊85個基因。三者均影響氧化應(yīng)激等過程，而MpGLK敲除還影響光合作用和葉綠素合成，對光合基因影響顯著，其他基因?qū)夂匣虮磉_(dá)控制有限，不足以影響葉綠體發(fā)生。

圖5. MpGLK調(diào)控光合作用相關(guān)基因的表達(dá)

為確定MpGLK的直接靶點(diǎn)，作者通過ChIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)了2654個可重復(fù)結(jié)合峰，其結(jié)合RGATTYY基序，與開花植物GLK相似，關(guān)聯(lián)到1326個靶基因。結(jié)合ATAC-seq和H3K4me3ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)MpGLK結(jié)合開放染色質(zhì)模式與擬南芥一致，40.4%的靶基因在Mpglk突變體中下調(diào)，35%在過表達(dá)株系中上調(diào)，且差異表達(dá)基因的結(jié)合強(qiáng)度更高，MpGLK靶基因差異表達(dá)比例高于開花植物。與五種開花植物對比，僅53個GLK靶基因保守（多參與光合作用），多數(shù)不保守。以上結(jié)果表明，GLK功能保守但調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已顯著分化?？缥锓N互補(bǔ)實驗進(jìn)一步證實了GLK在陸生植物葉綠體生物合成中仍起重要作用，但其作用的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)在苔蘚與被子植物分化后的4-5億年間已顯著分化。

圖6. MpGLK的ChIP-seq揭示了地錢與開花植物之間GLK結(jié)合的差異