m6A(N6-Methyladenosine)甲基化修飾已成為近年來科研圈的“明星"（通過Pubmed檢索"m6A"關(guān)鍵詞，可以看出近10年內(nèi)m6A的文章逐年增長，作為表觀轉(zhuǎn)錄組中化學(xué)修飾之一，m6A在多種生理過程中發(fā)揮著調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵作用。在了解m6A甲基化修飾之前，我們先了解一下什么是表觀轉(zhuǎn)錄組。

表觀轉(zhuǎn)錄組

表觀轉(zhuǎn)錄組（Epitranscriptome）指RNA分子上所有可逆化學(xué)修飾的集合，這些修飾不改變RNA序列，但可以通過調(diào)控基因表達(dá)（如翻譯、降解、剪接等）發(fā)揮作用。RNA修飾廣泛存在于各種RNA類型中，包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、siRNA、piRNA和lncRNA等。目前已知的 RNA修飾超過150種，常見類型包括甲基化（如m6A、m5C）、羥基化、假尿苷化（Ψ）等。其中RNA甲基化是最常見的修飾類型之一，在mRNA、tRNA等分子中占比較高（如哺乳動物 mRNA 中 m6A 修飾可占甲基化修飾的 80% 以上）。

RNA甲基化，是指在甲基轉(zhuǎn)移酶（如 METTL 家族、CMTR 家族等）的催化下，將甲基基團(tuán)（-CH3）通過共價鍵連接到RNA分子中核苷酸的特定原子上的修飾過程。RNA 甲基化修飾存在多種類型，包括 m6A、m5C、m1A、m7G 等。

m6A甲基化修飾

m6A甲基化修飾即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子（N6位）上的甲基化修飾。m6A甲基化修飾是真核生物mRNA的內(nèi)部修飾之一，約占到mRNA甲基化修飾的80%。m6A在調(diào)控基因表達(dá)（如調(diào)節(jié)mRNA可變剪切、穩(wěn)定性、降解速率及翻譯效率等）中起著重要作用。

m6A修飾主要發(fā)生在RRACH（R = G或A，H = A、C或U ）這類motif上，這類motif主要在mRNA的終止密碼子和3’UTR處富集，即m6A主要發(fā)生在終止密碼子和3’UTR附近。

研究表明，m6A最主要的功能是調(diào)控mRNA穩(wěn)定性：在胞質(zhì)中，m6A修飾可被閱讀器蛋白YTHDF2識別，通過招募相關(guān)因子將mRNA富集至Processing body（P-body），從而加速其降解。此外，m6A修飾可通過改變RNA局部二級結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)），暴露或遮蔽microRNA的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控microRNA介導(dǎo)的mRNA降解效率。在核內(nèi)，m6A修飾被核內(nèi)閱讀器YTHDC1識別后，可通過招募剪接因子（如SRSF家族蛋白）調(diào)控RNA可變剪接，并與核輸出受體NXF1互作促進(jìn)mRNA出核，最終實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控。值得注意的是，m6A與DNA甲基化之間存在雙向互作網(wǎng)絡(luò)，例如m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3可通過穩(wěn)定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的mRNA，間接增強(qiáng)基因組DNA甲基化水平，而DNA甲基化狀態(tài)也可通過表觀遺傳調(diào)控影響m6A相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄。

? 下圖展示了目前已知的部分m6A的生物功能。

m6A的調(diào)控機(jī)制：

m6A甲基化修飾是動態(tài)可逆的生物過程，這種動態(tài)變化依賴于多種功能的酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，主要包括三種類型：甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferases)、去甲基化酶(Demethylases)以及甲基化識別蛋白(Binding proteins)。

甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）也稱為 “寫入器"，負(fù)責(zé)催化 mRNA 等 RNA 分子的堿基發(fā)生 m6A 甲基化修飾。核心成員包括METTL3/METTL14 復(fù)合物（催化 m6A 的直接添加），以及輔助因子WTAP、VIRMA、KIAA1429等（參與酶復(fù)合物定位或底物識別），此外還包括METTL16、RBM15/15B、ZC3H3、CBLL1等具有特定生物學(xué)功能的甲基轉(zhuǎn)移酶。

去甲基化酶（Erasers）也稱為 “擦除器"，負(fù)責(zé)催化 m6A 修飾的去除。目前已知的 m6A 去甲基化酶包括FTO和ALKBH5，可特異性移除 mRNA 中的甲基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)修飾的動態(tài)調(diào)控。

m6A 識別蛋白（Readers）也稱為 “閱讀器"，通過特異性結(jié)構(gòu)域識別m6A修飾的RNA，招募下游效應(yīng)因子或改變RNA構(gòu)象，從而調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、剪接、翻譯等過程。主要分為兩類：

1、含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白：

• 胞質(zhì)型：YTHDF1（促進(jìn)翻譯）、YTHDF2（介導(dǎo)mRNA降解）、YTHDF3（協(xié)同前兩者功能）；

• 核內(nèi)型：YTHDC1（調(diào)控剪接和出核）、YTHDC2（參與翻譯起始）。

2、非YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白：

• IGF2BP1/2/3（通過m6A修飾增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性）；

• HNRNPA2B1（識別m6A并調(diào)控靶基因的選擇性剪接）。

不同物種中，m6A 閱讀器的功能存在特異性：例如，高海拔哺乳動物通過YTHDF1 識別缺氧相關(guān)基因（如 HIF-1α）mRNA 的 m6A 修飾，增強(qiáng)其翻譯效率，從而抵抗缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，體現(xiàn)了表觀調(diào)控對環(huán)境適應(yīng)的重要性。

M6A甲基化測序(MeRIP-seq)技術(shù)

m6A修飾早在1970年代通過放射性標(biāo)記技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，而其在轉(zhuǎn)錄組中的全基因組分布特征最早通過二代測序（NGS）技術(shù)揭示。研究表明，在哺乳動物中，約25%的mRNA分子含有m6A修飾，平均每個轉(zhuǎn)錄本攜帶1-3個修飾位點(diǎn)，主要分布于終止密碼子附近及3'UTR區(qū)域。

甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq/m6A-seq）通過特異性抗體富集含m6A的RNA片段，結(jié)合高通量測序可定位到約100 nt分辨率的修飾區(qū)域，已廣泛用于m6A修飾的檢測。

MeRIP-seq/m6A-seq技術(shù)原理為通過特異識別m6A修飾的抗體，對細(xì)胞內(nèi)具有m6A修飾的RNA片段進(jìn)行免疫共沉淀。對沉淀下來的RNA片段進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析，即可在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)解析m6A修飾的分布特征、富集序列模式及潛在調(diào)控功能。該技術(shù)是目前研究 m6A 修飾廣泛使用的方法之一，已被應(yīng)用于揭示m6A在發(fā)育、疾病等過程中的動態(tài)調(diào)控機(jī)制。

MeRIP-seq是基于免疫沉淀富集技術(shù)，該技術(shù)包括IP和input兩個文庫：IP文庫是通過m6A特異性抗體富集含甲基化修飾的RNA片段，用于檢測m6A修飾的分布；Input文庫為未進(jìn)行免疫沉淀的RNA樣本（處理流程與IP一致），作為對照用于排除非特異性結(jié)合。 通過比較IP與Input文庫的測序信號，可繪制全基因組范圍內(nèi)的m6A修飾圖譜，單獨(dú)的input文庫可視為RNA-seq文庫，可用于進(jìn)行表達(dá)圖譜的分析。

文庫構(gòu)建原理圖如下：

生信分析流程示意圖如下：

今天為大家介紹的內(nèi)容以基礎(chǔ)知識為主，旨在為大家筑牢理論根基，希望能對大家有所助益。后續(xù)我們將為大家分享m6A的應(yīng)用實(shí)例，敬請期待！

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